免疫酶組織化學技術(shù)的常用酶及其底物

（一）辣根過氧化物酶
在免疫酶技術(shù)中，辣根過氧化物酶（HRP）是、應用zui多的標記酶，是從一種稱為辣根的植物根部分離、純化獲得。HRP分子中含有含鐵血紅素基團（高鐵血紅素），是HRP的活性基團，在溶液中呈棕，HRP中的高鐵血紅素與H202形成一種復合物，然后脫水，氧原子形成。幾種底物可使HRP氧化，zui常用的有二種，即多酚和硝基鹽。HRP的優(yōu)點有以下幾個方面。
（1）體積小（分子質(zhì)量40kDa），不會遮蓋抗原的結(jié)合部位，且穿透力強，易與細胞內(nèi)抗原結(jié)合。
（2）穩(wěn)定且易獲得高純度酶制品。
（3）具有較高活性及特異性。
（4）不溶性好，終產(chǎn)物不向周邊擴散。
（5）組織中內(nèi)源性酶較少，抑制方法較多。
（6）價格相對較便宜。
（7）特異性底物是過氧化氫（H202），可選用不同電子供體（發(fā)色基團），使終產(chǎn)物呈不同顏色。例如3，3’—二氨基聯(lián)苯胺（DAB）為棕褐色，3—氨基—9—乙基卡巴唑（AEC）為紅色，4—氯—1—苯酚（CN）為藍色。AEC室溫下較穩(wěn)定，產(chǎn)物不溶于水，但溶于有機溶劑，所以不能進行脫水等處理；又因其需用水溶性封固劑，時間長易褪色，限制了其應用。DAB是廣泛應用的電子供體，產(chǎn)物既不溶于水，又不溶于有機溶液，可長期保存。其終產(chǎn)物具有嗜鋨性，經(jīng)鋨酸處理后電子密度增加，適用于電鏡下觀察。但DAB的缺點是具有潛在的致癌性，所以應盡量減少吸人和接觸次數(shù)，并嚴格管理廢液。盡管有人反對應用DAB，但目前還未找到一種比它更好的替代品，所以應用依然。

HRP與底物H202呈色反應原理見圖4—l。HRP的特異底物為H202，在分解Hz02過程中，與H202形成初級復合物，無電子供體時，反應不再繼續(xù)進行，當電子供體存在時，反應以一定的速度形成第二種復合物。HRP催化H202已形成的中間型產(chǎn)物，迅速生成水，酶被還原，電子供體被氧化、聚合，再經(jīng)氧化環(huán)化?zui后形成吲哚胺多聚體，此多聚體進一步氧化、環(huán)化，形成苯乙肼聚合體，如供氫體是DAB，產(chǎn)物為棕褐色；如是AEC，產(chǎn)物為紅色。
 

（二）堿性磷酸酶
目前商品化的AKP均來源于牛小腸，稱為牛腸堿性磷酸酶（calfintestinalkalinephos—phatase），其分子質(zhì)量為100kDa，故而穿透細胞組織的能力較弱。某些組織細胞內(nèi)含有較高的內(nèi)源性堿性和酸性磷酸酶，例如人體和鼠類、狗等動物組織的肝、腎、腸，對IHC染色會產(chǎn)生一定的干擾，因此限制了它的應用。AKP主要用于血涂片或骨髓涂片的白細胞抗原檢測。但是由于AKP的呈色反應的敏感性要比HRP高2—3倍，顯色時間可從30min到48h，可與HRP組合進行IHC的雙重或多重標記。另外，內(nèi)源性堿性磷酸酶可以在底物緩沖液中加入左旋咪唑（1evamisole）和鎂離子（氯化鎂），或提高底物緩沖液的pH值，可以有效地消除內(nèi)源性堿性磷酸酶，使該酶應用比例日趨增多。目前該酶已廣泛應用于原位雜交檢測的顯色和雙重酶標染色。

（三）葡萄糖氧化酶
葡萄糖氧化酶（glucoseoxdase，GOD）以葡萄糖為底物，生成藍色不溶性沉淀。該終產(chǎn)物較穩(wěn)定，不溶于有機溶劑，故易*保存，但因其分子質(zhì)量為150kDa，不能穿人細胞，影響了其應用。另外，該酶的敏感性較低，主要是酶與底物反應敏感性低。目前主要用于IHC的多重標記。
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