實時熒光定量PCR技術于1996年由美國Applied biosystems公司推出，它是一種在PCR反應體系中加入熒光基團，利用對熒光信號積累的實時檢測來監(jiān)測整個PCR進程，zui后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。定量PCR是在定性PCR技術基礎上發(fā)展起來的核酸定量技術。該技術不僅實現了對DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實現多重反應、自動化程度高、無污染、實時和準確等特點，目前已廣泛應用于分子生物學研究和醫(yī)學研究等領域。
 
1. 分子生物學研究
 
⑴ 基因表達研究：細胞因子是一種調節(jié)蛋白，它對免疫反應、炎癥反應具有重要的調節(jié)作用，包括對淋巴細胞激活、增生、分化、存活和凋亡的調節(jié)。這些低分子蛋白由淋巴細胞、單核細胞和內皮細胞所分泌，其量的改變常常與一些疾病，如炎癥反應、自身免疫性疾病、移植排斥反應等有密切的關系。由于所得到組織樣本常常因為太小而不能滿足在蛋白質水平的檢測，另外，通常用的蛋白質檢測方法的靈敏度也難以完成對極微量的蛋白產物的檢測，所以應用PCR檢測細胞因子mRNA表達水平就顯得很有意義。實驗研究表明：定量結腸直腸癌淋巴結的癌抗原mRNA的表達量，可以作為診斷癌癥微轉移的重要依據。

⑵ 單核苷酸多態(tài)性及突變分析：實時熒光定量PCR一個誘人的應用前景是用于檢測基因突變和基因組的不穩(wěn)定性。基因突變的檢測基于兩條探針，一條探針橫跨突變位點，另一條為錨定探針，與無突變位點的靶序列雜交，兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團標記。如靶序列中無突變，探針雜交便會降低雜交體的穩(wěn)定性，從而降低其熔解溫度（Tm）。這樣便可對突變和多態(tài)性進行分析。拉米夫定是有效治療慢性乙型肝炎的抗病毒藥物，但臨床應用中不斷有病毒變異的報道，這些變異可能是治療失敗或病毒對治療無反應的原因。實時熒光定量PCR可以監(jiān)測乙型肝炎患者服用拉米夫定后體內是否產生耐藥突變病毒。

2. 醫(yī)學研究

1）產前診斷：到目前為止，人們對遺傳性物質改變引起的遺傳性疾病還無法治療，只能通過產前監(jiān)測，減少病嬰出生，以防止各類遺傳性疾病的發(fā)生，如為減少X連鎖遺傳病患兒的出生，從孕婦的外周血中分離胎兒DNA，用實時熒光定量PCR檢測其Y性別決定區(qū)基因是一種無創(chuàng)傷性的方法，易為孕婦所接受。

2）病原體檢測：目前，采用熒光定量PCR檢測技術可以對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類乳頭瘤病毒、單純皰疹病毒、人類免疫缺陷病毒、肝炎病毒、流感病毒、結核分枝桿菌、EB病毒和巨細胞病毒等病原體進行定量測定。與傳統(tǒng)的檢測方法相比具有靈敏度高、取樣少、快速簡便等優(yōu)點。

3） 藥物療效考核：對乙型肝炎病毒 （HBV）、丙型肝炎病毒 （HCV） 定量分析顯示：病毒量與某些藥物的療效關系。HCV高水平表達，干擾素治療作用不敏感，而HCV低滴度，干擾素作用敏感；在拉米夫定治療過程中，HBV-DNA的血清含量曾有下降，隨后若再度上升或超出以前水平，則提示病毒發(fā)生變異。

4）腫瘤基因檢測：盡管腫瘤發(fā)病的機理尚未清楚，但相關基因發(fā)生突變是致癌性轉變的根本原因已被廣泛接受。癌基因的表達增加和突變，在許多腫瘤早期就可以出現。實時熒光定量PCR不但能有效地檢測到基因的突變，而且可以準確檢測癌基因的表達量。目前用此方法進行過端粒酶hTERT基因、慢性粒細胞性白血病WT1基因、腫瘤ER基因、前列腺癌PSM基因、腫瘤相關的病毒基因等多種基因的表達檢測。隨著與腫瘤相關的新基因的不斷發(fā)現，熒光定量PCR技術將會在腫瘤的研究中發(fā)揮更大的作用。
 

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